Università Roma Tre

Modulo di Metodologie Biochimiche (Prof.ssa Alessandra di Masi)

- Le metodologie biochimiche nella ricerca scientifica. Strumentazione di base nel laboratorio di biochimica (vetreria, bilance, agitatori, sistemi termostatati, pHmetri, cappe, centrifughe).
- Volumetria e pesate. Preparazioni di soluzioni, diluizioni, sistemi tampone.
- Produzione di proteine ricombinanti: clonaggio, mutagenesi, sistemi di espressione in batteri, lieviti, cellule di mammifero, cellule di insetto. Proteine di fusione.
- Metodi per la purificazione delle proteine: tecniche di separazione. Estrazione delle proteine dalla fonte biologica. Metodi di frazionamento di miscele proteiche. Omogenizzazione di cellule con potter, ultraturrax, sonicazione, omogenizzatori in continuo a pressione (1° Esperienza di laboratorio).
- Purificazione delle proteine con tecniche cromatografiche: gel filtrazione, cromatografia a scambio ionico, cromatografia di affinità, cromatografia di immunoaffinità, cromatografia per interazioni idrofobiche, cromatografia a fase inversa. Applicazioni dell’HPLC (con esperienza di laboratorio) (2° Esperienza di laboratorio).
- Quantificazione delle proteine. (3° Esperienza di laboratorio)
- Elettroforesi. Elettroforesi su gel di poliacrilammide in condizioni native o denaturanti (SDS-PAGE) tecniche di rivelazione, analisi quantitativa densitometrica delle bande, determinazione del peso molecolare, elettroforesi su gradiente, elettroforesi preparativa, isoelettrofocalizzazione, elettroforesi bidimensionale. (4° Esperienza di laboratorio)
- Tecniche immunochimiche: anticorpi, western blotting, ELISA e RIA, immunoprecipitazione. (5° Esperienza di laboratorio)
- Metodi spettroscopici per lo studio delle proteine. Spettroscopia di assorbimento UV-VIS. Spettroscopia di fluorescenza. Spettroscopia a luce polarizzata. Spettroscopie avanzate. (6° Esperienza di laboratorio)
- Studio degli enzimi e delle proteine. Cinetica enzimatica: calcolo della Km, Ki, Ka. Studio del tipo di inibizione: competitiva, non competitiva, incompetitiva e mista. Uso degli analoghi dei substrati, effetto del pH e della temperatura (7° Esperienza di laboratorio).
- Dosaggio dei metaboliti. Deproteinizzazione acida o basica. Dosaggio di metaboliti con metodi spettrofotometrici, spettrofluorimetrici, Dosaggio ATP, glucosio. Uso dell’HPLC nel dosaggio dei metaboliti.
- Metodi biochimici per l’analisi delle interazioni molecolari. Analisi proteine ligando. Analisi di interazione tra proteine.

- Keith Wilson and John Walker: Biochimica e biologia molecolare: principi e tecniche. EDs. 2019 Raffaello Cortina Editore.
- M.Maccarrone. Metodologie Biochimiche e Biomolecolari, Zanichelli Editore
- Bonaccorsi, Contestabile, Di Salvo. Metodologie biochimiche, Zanichelli Editore.

Le slide di ciascuna lezione saranno rese disponibili.