Università Roma Tre

Il corso si pone l'obiettivo di fornire allo studente le conoscenze teoriche e competenze tecniche per affrontare lo studio morfologico ultrastrutturale di materiali biologici. Lo studente sara' in grado di predisporre autonomamente un protocollo sperimentale adeguato alla tipologia di campione e all'obiettivo di indagine. Le conoscenze acquisite durante il corso permetteranno inoltre allo studente di effettuare un'analisi critica dei risultati morfologici in un contesto funzionale.

Al termine del corso lo studente avrà acquisito:
1) Conoscenza dei principi di base di microscopia elettronica;
2) Conoscenza e competenza sulle metodologie relative alla preparazione di campioni biologici di diversa natura (organismi procarioti ed eucarioti) per l'analisi ultrastrutturale;
3) Competenze di base per l'uso di strumenti di indagine ultrastrutturale (microscopi a scansione, a trasmissione e a fascio ionico);
3) Capacità di osservazione, cattura ed elaborazione di immagini microscopiche;
4) Competenza di base per l'interpretazione qualitativa e l'analisi quantitativa di dati ultrastrutturali.

Programma delle lezioni e delle esercitazioni
Principi di microscopia elettronica. Microscopia a trasmissione (tem). Microscopia a scansione (sem). Microscopia a fascio ionico (fib/sem). Studio della composizione atomica mediante sonda edax.
La preparazione dei campioni biologici per l'analisi morfologica: principi generali. Prelievo dei campioni. Metodi di fissazione: modalità per immersione, per perfusione. Fissativi coagulanti e non coagulanti. Metodi di post-fissazione per la microscopia elettronica. Tecniche di criofissazione.
Tem: disidratazione ed inclusione in resine acriliche ed epossidiche. Ultramicrotomia: allestimento di lame di vetro, sezionamento di fettine sottili ed ultrasottili. Uso delle lame di diamante. Raccolta delle sezioni su reticelle e contrasto. Utilizzo del tem: allineamento del cannone, posizionamento del campione, messa a fuoco, cattura delle immagini.
Sem: metodi di disidratazione e utilizzo del critical point dryer. Montaggio e metallizzazione dei campioni mediante sputter-coater. Utilizzo del sem nelle modalita' di rilevazione di elettroni secondari e retrodiffusi. Cattura delle immagini e analisi morfometriche.
Fib/sem: utilizzo del microscopio fib/sem su campioni predisposti per tem e sem. Tecniche di milling, deposition. Preparazione di lamelle tem. Cross sections. Acquisizione di immagini seriate e loro processamento.
Immunolocalizzazione pre- e post-embedding: metodiche immunoenzimatiche e uso di anticorpi coniugati a nanoparticelle di oro colloidale.

Saranno messe a disposizione dello studente dispense delle lezioni e delle esercitazioni.

Il docente riceve tutti i giorni dalle 10:00 alle 13:00, anche per fornire ulteriori referenze bibliografiche, previo appuntamento via mail:
sandra.moreno@uniroma3.it

PRINCIPI DI MICROSCOPIA ELETTRONICA. MICROSCOPIA A TRASMISSIONE (TEM). MICROSCOPIA A SCANSIONE (SEM). MICROSCOPIA A FASCIO IONICO (FIB/SEM). STUDIO DELLA COMPOSIZIONE ATOMICA MEDIANTE SONDA EDAX.
LA PREPARAZIONE DEI CAMPIONI BIOLOGICI PER L’ANALISI MORFOLOGICA: PRINCIPI GENERALI. PRELIEVO DEI CAMPIONI. METODI DI FISSAZIONE: MODALITÀ PER IMMERSIONE, PER PERFUSIONE. FISSATIVI COAGULANTI E NON COAGULANTI. METODI DI POST-FISSAZIONE PER LA MICROSCOPIA ELETTRONICA. TECNICHE DI CRIOFISSAZIONE.
TEM: DISIDRATAZIONE ED INCLUSIONE IN RESINE ACRILICHE ED EPOSSIDICHE. ULTRAMICROTOMIA: ALLESTIMENTO DI LAME DI VETRO, SEZIONAMENTO DI FETTINE SOTTILI ED ULTRASOTTILI. USO DELLE LAME DI DIAMANTE. RACCOLTA DELLE SEZIONI SU RETICELLE E CONTRASTO. UTILIZZO DEL TEM: ALLINEAMENTO DEL CANNONE, POSIZIONAMENTO DEL CAMPIONE, MESSA A FUOCO, CATTURA DELLE IMMAGINI.
SEM: METODI DI DISIDRATAZIONE E UTILIZZO DEL CRITICAL POINT DRYER. MONTAGGIO E METALLIZZAZIONE DEI CAMPIONI MEDIANTE SPUTTER-COATER. UTILIZZO DEL SEM NELLE MODALITA’ DI RILEVAZIONE DI ELETTRONI SECONDARI E RETRODIFFUSI. CATTURA DELLE IMMAGINI E ANALISI MORFOMETRICHE.
FIB/SEM: UTILIZZO DEL MICROSCOPIO FIB/SEM SU CAMPIONI PREDISPOSTI PER TEM E SEM. TECNICHE DI MILLING, DEPOSITION. PREPARAZIONE DI LAMELLE TEM. CROSS SECTIONS. ACQUISIZIONE DI IMMAGINI SERIATE E LORO PROCESSAMENTO.
IMMUNOLOCALIZZAZIONE PRE- E POST-EMBEDDING: METODICHE IMMUNOENZIMATICHE E USO DI ANTICORPI CONIUGATI A NANOPARTICELLE DI ORO COLLOIDALE.

DISPENSE E MATERIALE INFORMATICO FORNITI DAI DOCENTI.

Orario di Ricevimento: tutti i giorni della settimana previo appuntamento per email (andrea.digiulio@uniroma3.it)